Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (tests ELISA) sont utilisés pour mesurer une concentration inconnue d'antigène ou d'anticorps. Le test est rapide et précis. Dans le test ELISA sandwich, un antigène purifié est appliqué au fond d'un puits dans une plaque de 96 puits. L'anticorps cible est ensuite ajouté et se lie à l'antigène, suivi par un anticorps secondaire marqué qui se lie à la cible. Les produits non liés sont éliminés entre chaque étape grâce à des lavages. Enfin, un substrat colorimétrique est ajouté pour réagir avec le marqueur porté par l'anticorps secondaire. Pour obtenir des résultats quantitatifs, un anticorps standardisé et purifié peut être utilisé à titre de comparaison pour déterminer la quantité absolue de protéine dans l'échantillon étudié. En variante, si la concentration d'un antigène inconnu est attendue, le sandwich peut être inversé, avec un anticorps fixé au fond des puits, l'antigène ajouté se lie à l'anticorps, et un anticorps secondaire marqué est utilisé pour détecter la quantité d'antigène.
Matériel :
- Plaque de 96 puits
- Echantillon de l’anticorps cible
- Standard calibré de l’anticorps cible
- Antigène purifié qui cible l’anticorps qui devra s’y lier
- Anticorps secondaire marqué qui se liera à une cible d'anticorps qui se liera à l’anticorps cible
- Tampon de coating (50 mM Sodium Carbonate, pH 9.5)
- Wash buffer (10mM Tris, 1M Sodium Chloride, pH 7.2, 0.05% (v/v) Kathon)
- Tampon de blocage (10 mM Tris, pH 7.2, 10% (w/v) D-Gluconic Acid, 5% (w/v) BSA)
- Diluant des anticorps (PBS)
- Substrat colorimétrique
- Solution stop
- Lecteur de plaque ELISA
Coating de l’antigène
1. Préparer un 1 pg/ml de dilution de l'antigène purifié, en utilisant le tampon de coating comme diluant.
2. Ajouter 100 µl de l’antigène dilué à autant de puits que nécessaire de la plaque.
3. Si vous utilisez une courbe standard, 33 puits seront nécessaires pour 11 dilutions testées en triple. Des puits seront également nécessaires pour tester au moins 2 dilutions de l'échantillon.
4. Ajouter 100 µl du tampon de coating (sans l’antigène) à un ensemble de puits pour la courbe standard et l'échantillon comme contrôle négatif.
5. Incuber la plaque pendant 3 heures à température ambiante ou à 4°C sur la nuit.
6. Recouvrir chaque puits de la plaque avec un tampon de lavage et retirer délicatement le liquide en retournant la plaque. Laver la plaque 3 fois et sécher sur papier absorbant.
Etape de blocage
1. Ajouter 375 µl du tampon bloquant dans chaque puits.
2. Incuber les plaques pendant 2 heures à température ambiante, ou 4 à 24 heures à 4°C.
3. Retirer le tampon de blocage et tapoter la plaque. Les plaques bloquées peuvent être stockées avec un film protecteur à 4°C jusqu’à deux semaines maximum.
Anticorps inconnu et courbe standard
1. Pour préparer une courbe standard, diluer l'anticorps de contrôle à 1 pg/ml dans du PBS. Préparer des dilutions en série allant de 1 pg/ml à 0,0039 µg/ml. Inclure un puits avec uniquement du PBS (le blanc) comme contrôle négatif. Ajouter 100 µl de chaque dilution dans les puits coatés. Chaque dilution (incluant le blanc) doit être ajoutée en triplicate.
2. Diluer l’échantillon de l’anticorps à des dilutions appropriées dans PBS. Ajouter 100 µl de chaque dilution de l’échantillon test aux puits coatés. Inclure un blanc comme contrôle négatif.
3. Incuber les plaques pendant une heure à température ambiante.
4. Laver les plaques 3 fois avec du tampon de lavage et sécher.
Anticorps secondaire marqué
1. Diluer l'anticorps secondaire marqué à 0,5 pg/ml dans du PBS. Ajouter 100 µl de l'anticorps dilué dans chaque puits.
2. Incuber la plaque pendant 60 minutes à température ambiante.
3. Laver la plaque 5 fois avec le tampon de lavage et sécher.
Détection de l’anticorps et lecture de la plaque
1. Immédiatement avant utilisation, préparer le réactif colorimétrique et ajouter 100 µl à chaque puits. Incuber jusqu'à ce que la couleur se développe, puis stopper la réaction avec la solution appropriée. Par exemple, si un conjugué HRP est utilisé comme anticorps secondaire marqué, préparer un mélange 1:1 de solution de TMB et de la solution peroxyde. Ajouter 100 µl du mélange à chaque puits et incuber pendant environ 15 minutes jusqu'à ce que les puits deviennent bleus. Stopper la réaction en ajoutant 100 µl d'acide sulfurique 2N dans chaque puits.
2. Lire la plaque à une longueur d'onde appropriée. Pour l’HRP, lire la plaque à 450 nm.
3. Tracer l'absorbance des dilutions d'anticorps standard en relation avec leurs concentrations et tracer une ligne de meilleur ajustement.
4. Comparer l'absorbance de l'échantillon d'essai à la courbe standard pour déterminer la concentration. Multiplier les valeurs par le facteur de dilution approprié.
Troubleshooting:
1. Contrôle négatif donne un résultat positif – Vérifier si il y a une contamination de la solution de substrat, l’anticorps secondaire conjugué, ou les contrôles.
2. Aucune coloration du contrôle positif ou des échantillons – Vérifier les dates d’expiration, les concentrations, les conditions de conservation des réactifs.
3. Très faible coloration des contrôles positifs ou des échantillons - Vérifier les dilutions de l’anticorps secondaire conjugué et la concentration du substrat.
4. Coloration de l’échantillon test mais pas des contrôles positifs – Vérifier les dates d’expiration et les conditions de conservation des contrôles positifs.
5. La coloration est présente mais but l’absorbance est plus faible que prévue – Vérifier le réglage de la longueur d'onde.
Références:
Using Antibodies: A Laboratory Manual. Harlow & Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1999.
Introduction to Antibodies, 2nd Edition. Chemicon International.