Méthode ELISA : 4 principaux tests et réactifs annexes


1. La technique ELISA


L’ELISA est une technique très répandue dans les laboratoires, grâce à son faible coût et sa facilité de réalisation.

A l’origine, la méthode immuno-enzymatique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) a été créée pour remplacer les procédés de dosage radio-immunologiques utilisant la radioactivité. 


La technique ELISA est une technique de dosage immunologique qui permet la détection d’un antigène ou d’un anticorps dans un échantillon. Le principe de cette technique repose sur la visualisation d’une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction enzymatique colorimétrique. L’enzyme, préalablement couplée à l’anticorps, catalyse une réaction chimique qui transforme son substrat en composé coloré. 


La méthode ELISA peut être quantitative ou qualitative :

- Qualitative : le résultat indique la présence ou l’absence d’un antigène ou d’un anticorps dans un échantillon.
- Quantitative : la densité optique ou les unités de fluorescence d’un échantillon sont intercalées sur une courbe d’étalonnage, permettant le calcul de la concentration présente dans l’échantillon. 

Il existe différentes méthodes ELISA. En effet, la révélation peut être directe (l’anticorps primaire est directement couplé à l’enzyme) ou indirect (l’anticorps secondaire anti-lapin ou souris est couplé à l’enzyme). La révélation indirecte est le plus couramment utilisée

2. Les différentes techniques

Il existe quatre principaux types de test ELISA : direct, indirect, sandwich et compétitif.


ELISA direct


- Coating : Antigène 

- Capture : Anticorps spécifique de l’Antigène, couplé à une enzyme

- Détection : Non nécessaire

- Substrat

Avantages :


  • Simple et rapide - un seul anticorps nécessaire et un procédé en quelques étapes seulement

  • Moins de possibilités d'erreurs - nombre relativement faible d'étapes de pipetage par rapport aux autres méthodes ELISA et, en raison de la nécessité d'un seul anticorps, pas de risque de réactivité croisée des anticorps


Inconvénients :

  • Sensibilité limitée - pas d'étape d'amplification du signal

  • La mise au point du test prend du temps - chaque cible de test nécessite un anticorps primaire conjugué spécifique, ce qui rend le test relativement coûteux

  • Risque de réactivité limitée de l'anticorps - la fixation de l'enzyme à l'anticorps peut limiter la disponibilité spatiale des sites sur l'anticorps qui devraient se fixer à l'antigène

ELISA Indirect


- Coating : Antigène 

- Capture : Anticorps spécifique de l’Antigène

- Détection : Anticorps secondaire couplé à une enzyme

- Substrat

Elisa indirect

Avantages :


  • Flexibilité – de nombreux anticorps secondaires marqués sont disponibles dans le commerce

  • Sensibilité - plus d'un anticorps marqué peut se lier à l'anticorps primaire car chaque anticorps primaire contient plusieurs épitopes

  • Immunoréactivité maximale - aucun marqueur n'interfère avec les sites de l'anticorps primaire

  • Économique - pas d'anticorps primaires marqués nécessaires

Inconvénients :

  • Flux de travail plus complexe - une étape d'incubation supplémentaire est nécessaire pour l'anticorps secondaire

  • Potentiel de réactivité croisée - signal non spécifique possible dû à une réactivité croisée avec l'anticorps secondaire

ELISA Sandwich


Le principe de l’ELISA sandwich consiste à piéger, entre un « anticorps de capture » et un « anticorps de détection », les antigènes d’intérêt.


- Coating : Anticorps spécifique (= anticorps de capture) de l’Antigène à doser 

- Capture : Antigène d’intérêt

- Détection : Deuxième anticorps monoclonal (= anticorps de détection), reconnaissant l’Antigène via un épitope différent de l’Anticorps de capture, couplé à une enzyme (si ce deuxième anticorps n’est pas couplé à une enzyme, alors un Anticorps secondaire couplé à une enzyme est nécessaire)

Elisa sandwich

Avantages :

  • Flexibilité et sensibilité - des méthodes de détection directes et indirectes peuvent être utilisées

  • Haute spécificité - deux anticorps sont utilisés pour détecter l'antigène

  • Convient aux échantillons complexes - la purification de l'antigène avant la mesure n'est pas nécessaire

Inconvénients :

  • Flux de travail complexe - nécessite plus d'étapes d'incubation que les autres types d'ELISA

  • Nécessite davantage d'optimisation - la réactivité croisée entre les différents anticorps utilisés doit être vérifiée

  • Besoin de 2 anticorps reconnaissant des épitopes différents

ELISA Compétitive

- Coating : Anticorps spécifique de l’Antigène

- Capture : mélange de l’Antigène d’intérêt non couplé et couplé à une enzyme

- Optimal pour des petits antigènes ou l’utilisation d’un seul anticorps

Avantages :

  • La plus grande flexibilité - peut être basée sur le format ELISA direct, indirect ou sandwich

  • Spécificité maximale - l'antigène est spécifiquement capturé et détecté

  • Très robuste - minimise les effets de la dilution de l'échantillon et les effets de la matrice de l'échantillon

Inconvénients :

  • Plutôt long - protocole très complexe

  • Les inconvénients du type de test (direct, indirect ou sandwich) choisi s'appliquent

3. Les réactifs annexes ELISA

Protocole ELISA disponible ici.

Pour réaliser et optimiser vos ELISA, Diagomics vous propose des bloquants, des tampons et des stabilisateurs.

Bloquants :


Désignation

Intérêt

Résultats

The Blocking Solution

Tampon de blocage à base de caséine permettant de saturer les sites libres du support plastique et empêchant la liaison non spécifique aux surfaces.

110-050

110-125

110-500

SmartBlock

Tampon de blocage BSA-free, composé de peptides modifiés, permettant d’améliorer l’efficacité de blocage.

113-125

113-500

BSA - Block

Tampon de blocage à base de BSA permettant de saturer les sites libres du support plastique.

115-125

115-500

Tampons :

Désignation

Intérêt

Référence

LowCross-Buffer

Tampon de dilution des échantillons ou des anticorps minimisant les réactions croisées et les effets matrice des échantillons.

100-050

100-125

100-500

Assay Defender

Tampon de dilution des échantillons permettant de bloquer les HAMA (human anti-mouse antibodies) et minimisant les liaisons non spécifiques, les réactions croisées et les effets matrice des échantillons.

180-050

180-125

180-500

Sample Buffer

Tampon de dilution pour les échantillons ou les anticorps.

105-050

105-125

105-500

Coating Buffer 10X

Tampon pour immobiliser, par adsorption, des protéines ou des anticorps sur des surfaces en plastique (disponible en pH 7,4 ou pH 9,6).

120-125

120-500

121-125

121-500

Washing Buffer 10X

Tampon de lavage PBS ou Tris

140-500

145-500

Stabilisateurs :

Désignation

Intérêt

Référence

Antibody Stabilizer Tris* 

Tampon Tris de dilution des protéines ou des anticorps permettant une conservation longue à 2-8°C.

*existe aussi en PBS (131-050)

130-050

130-125

130-500

Liquide Plate Sealer

Tampon stabilisant les anticorps ou les antigènes une fois fixés sur une surface en plastique.

160-050

160-125

160-500

LowCross HRP-STAB

Tampon de dilution pour le stockage à long terme des anticorps couplés HRP, minimisant les liaisons non spécifiques, les réactions croisées et les effets matrice.

270-050

270-125

270-500

HRP-Protector

Tampon de dilution pour le stockage à long terme des anticorps couplés HRP.

222-050

222-125

222-500